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   大连医科大学学报  2019, Vol. 41 Issue (4): 373-375      DOI: 10.11724/jdmu.2019.04.18
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1例A3亚型的血清学和分子生物学鉴定分析
肖南, 周世航, 王霓, 陈玫, 段莹    
大连市血液中心 血型室,辽宁 大连 116001
关键词ABO血型    A3亚型    ABO基因    测序    
1 材料和方法 1.1 标本来源

患者,女,61岁,临床诊断血小板减少症,2017年10月8日由所在医院申请血小板输注。医院输血科使用血型卡鉴定ABO血型时出现正定型抗-A“双视野”外观,反定型A型的现象。遂抽取5 mL患者EDTA抗凝血向我实验室申请ABO疑难血型鉴定。

1.2 试剂

微柱凝胶卡(BIO RAD),抗-A抗-B血型定型试剂(单克隆抗体)(长春博德生物技术有限责任公司),人ABO反定型用红细胞试剂盒(北京金豪制药股份有限公司),抗-A1(Biotest),抗-AB(DIAGAST),抗-H(上海血液生物医药生物有限责任公司),ABO血型基因检测试剂盒(天津秀鹏生物技术开发有限公司),DNA提取条102(台湾RBCBioseience公司),以上试剂均在有效期内。ABO基因扩增引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3 仪器

离心机(日本KUBOTA KA-2200),水浴箱(上海恒一仪器DK-600A),显微镜(日本尼康E100),核算自动纯化系统(台湾RBCBioseience MagCore HF16),PCR扩增仪(日本TaKaRa TP-600),ABO基因测序由宝生物公司提供。

1.4 血清学试验

按照说明书进行微柱凝胶卡ABO血型鉴定;按照全国临床检验操作规程(第4版)[1]ABO血型鉴定试管法的操作规程进行血型鉴定。游离红细胞制备:取2 mL压积红细胞与抗-A充分反应,多次离心,去除凝集块。剩余红细胞沿试管壁缓慢加入生理盐水,悬起红细胞,吸取上4/5的红细胞悬液进行下一遍洗涤,上述步骤重复5次。显微镜证实红细胞悬液底部无凝集细胞存在后,制备完成。按照文献[2]将游离红细胞与抗-A进行吸收放散试验。

1.5 ABO基因测序

参照文献[3]设计引物对ABO基因6、7外显子和5、6内含子进行扩增。PCR扩增条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s,循环30次,72 ℃延伸5 min。基因序列结果用genestar软件进行数据分析。

2 结果 2.1 ABO血型血清学微柱凝胶法

微柱凝胶卡ABO血型鉴定结果见图 1,抗-A呈现“双群”。

A:抗-A;B:抗-B; C:抗-D; D:AC; E:BC; F:OC 图 1 微柱凝胶卡ABO血型鉴定 Fig 1 ABO blood type microcolumn gel card test
2.2 ABO血型血清学试验试管法

室温3000 r/min离心15 s后,轻摇试管发现明显的混合视野,2次离心后凝集加强仍显示混合视野,显微镜下观察到大块的凝集细胞被游离红细胞包围,印证了混合视野的存在。见表 1

表 1 ABO血型血清学试验 Tab 1 Serological test of ABO blood type
试验方法 抗-A 抗-B AC BC OC 自身 抗-AB 抗-A1 抗-H A1C A2C
盐水室温1次离心 3+mf 0 0 4+ 0 0 3+mf wmf 3+ 0 0
盐水室温2次离心 4+mf 0 0 4+ 0 0 - - - - -
O型红细胞 - - - - - - - - 4+ - -
B型红细胞 - - - - - - - - 2+ - -
注: +~4+表示凝集强度递增;mf表示混合凝集反应;0表示无凝集反应;-表示未做
2.3 吸收放散试验

吸收放散试验阳性对照、阴性对照结果正确,患者放散液与AC反应阳性。

2.4 PCR产物测序分析

将扩增后的PCR产物进行测序,检出第7外显子编码区c:467C>T突变(图 2),第6外显子编码区c:261G del(图 3),与BGMUT数据库的ABO基因参比等位基因进行比对,基因型为A102 /O01。

图 2 第7外显子467C突变为T Fig 2 A transition (c: 467C>T) in exon 7
图 3 第6外显子261G缺失 Fig 3 A deletion (c: 261G del) in exon 6
3 讨论

本例用微柱凝胶卡鉴定ABO血型离心后出现凝集的红细胞位于凝胶顶部,未凝集红细胞位于微柱凝胶底部的“双群”现象。试管法室温离心后,呈现明显的混合视野。为使IgM型抗体和相应抗原结合更紧密、更完全。遂进行2次离心,凝集确有加强,但依然呈现混合视野,显微镜下观察呈明显的两群细胞。红细胞与抗-AB、抗-A1反应亦呈现混合视野。混合视野是A3型红细胞血清学反应的最大特点。H抗原在A型、B型、AB型及O型的红细胞上的分子数或密度存在很大差异,且存在以下规律O>A2>B>A1>A2B>A1B,而A3亚型的H抗原强度和A2类似,也介于O型和B型之间[4]。本例红细胞与抗-H的反应弱于O细胞,强于B细胞,结合其与抗-A、抗-A1、抗-AB出现的混合凝集反应,判定本例为A3亚型。

A3应与Aend和Amos嵌合体型进行区别。Aend凝集的红细胞 < 10%,凝集强度1+/mf左右[5],本例与抗-A1的反应凝集强度为3+/mf,混合视野中凝集的红细胞≥50%,排除Aend。Amos嵌合体型是A细胞和O细胞的混合型,吸收放散试验放散液与AC不发生凝集反应,不能吸收放散抗-A。本例将混合凝集中与单克隆抗体凝集的细胞去除,对游离细胞进行吸收放散试验,放散液与AC呈凝集反应,证实能够吸收放散抗-A,排除Amos嵌合体型。

ABO亚型是由于血型基因一个或多个碱基发生改变,使糖基转移酶构象发生改变,或导致改变的氨基酸处于ABO血型基因编码转移酶活性区域,影响了酶的活性,即碱基改变导致糖基转移酶活性部分丧失,使得抗原的抗原性减弱,从而表现出弱凝集反应[4]。本例第7外显子编码区c:467C>T突变,使第156位的普氨酸变成亮氨酸,为A102等位基因,第6外显子编码区c:261G del,使第261位后发生阅读框架移位,肽链在117位氨基酸终止转移酶的翻译,为O01等位基因,基因型为A102/O01。对于ABO亚型,血清学和基因型结果并不是完全对应的,会存在部分不一致的现象。本例也发现血清学和基因型结果是不一致的。国内也有血清学和基因型结果不一致的报道,其中1例血清学为A3B、而基因型A102/B101,另1例血清学为A3、而基因型为A102 / O01[6-7]。目前导致血清学结果和基因型不一致的原因尚没有确切的报道,需要进一步研究。我们发现本例及以上2例文献报道,均发生467C>T突变,因而我们推测467C>T突变是导致A3出现的原因之一。该突变是否一定导致A3亚型的出现,或者其他因素影响有待于进一步探讨。需要在今后的工作中积累样本,全面研究该类亚型的分子生物学基础。

综上所述,虽然ABO亚型在人群中比例不高,但其血清学试验表现出的抗原凝集强度减弱或增强、混合外观凝集、含有抗-A1等现象[1, 8],极易导致漏检或误判,给ABO血型鉴定和交叉配血带来困难。基因分型技术可以帮助血型的鉴定,在分子水平上对特殊血型的异常血清学反应进行解释,但不能取代血清学方法,不管血型基因型如何改变,血清学实验还是临床输血的金标准,正确鉴定ABO及其亚型对临床输血的安全至关重要。

参考文献
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文章信息

肖南, 周世航, 王霓, 陈玫, 段莹
1例A3亚型的血清学和分子生物学鉴定分析
大连医科大学学报, 2019, 41(4): 373-375.
通信作者
周世航,主任技师。E-mail:zshsail@163.com.

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