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   大连医科大学学报  2020, Vol. 42 Issue (3): 247-251, 269      DOI: 10.11724/jdmu.2020.03.13
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Dickkopf家族在肝癌发生发展中的作用研究进展
王晓艳, 权会琴, 杜虹, 申焕君, 王平忠    
空军军医大学 唐都医院 传染病诊疗中心, 陕西 西安 710038
摘要:肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,病毒感染和环境因素均可以导致肝癌。目前关于HCC的研究已有许多,但是其发展的具体分子机制仍不清楚。Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤发生有着密切的关系,该通路的异常活化参与了包括肝癌等多种肿瘤的发病过程。Dickkopf(DKK)家族是Wnt信号通路的关键抑制剂,可以调节HCC的发生发展。此外,DKK在组织和血清中的表达对肿瘤也具有诊断和预后价值。本文对DKK家族成员在肝癌发生发展中的作用研究进展进行综述。
关键词HCC    Wnt/β-catenin    Dickkopf    
Recent progress of Wnt pathway inhibitor Dickkopf in the development of hepatocellular carcinoma
WANG Xiaoyan, QUAN Huiqin, DU Hong, SHEN Huanjun, WANG Pingzhong    
Center of Infectious Diseases, Tangdu Hospital, Air-Force Military Medical University, Xi'an 710038, China
Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies in the world. There are multiple etiologic factors including viral and environmental influences that can lead to HCC. At present, there are many researches on HCC, however the molecular mechanism of its specific development is still unclear. Abnormal activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway is involved in the pathogenesis of various cancers and has been found to contribute to the development and progress of HCC. Dickkopf (DKK) family is a key inhibitor of the Wnt signaling pathway, which can regulate the development of HCC. In addition, DKK levels in tissues and serum have diagnostic and prognostic values. This article reviews the specific research progress of four DKK family members in HCC, and provides novel ideas for future treatment of HCC.
Keywords: HCC    Wnt/β-catenin    Dickkopf    

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤之一,占所有肿瘤的5%以上[1-2],每年全球约有50万~100万的新发病例[3]。HCC的发展具有与其他实体瘤类似的多步致癌过程,但有不同的病因。乙型肝炎(HBV)或丙型肝炎(HCV)病毒感染、大量酒精摄入、长期膳食暴露于黄曲霉毒素或氯乙烯,以及原发性血色素沉着症等都与HCC发生发展有关[4]。其中,Wnt/β-catenin通路异常活化对HCC的发生发展可能起促进作用。

1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt是一种富含半胱氨酸的糖蛋白,其信号通路高度保守,在多种生物学过程中发挥重要作用,比如胚胎发育、体内动态平衡和癌症[5-6]。Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤有着密切的关系,该通路的异常活化参与人类多种癌症的发病过程。在Wnt信号通路中,Fzd受体结合共受体LRP5/6形成复合体能够激活Wnt经典通路和Wnt非经典通路。目前关于经典通路研究得相对较多。正常情况下,经典通路中β-catenin结合GSK3β, CKI, axin和APC,GSK3β磷酸化β-catenin,随后被泛素化并导致降解;在受到刺激时,GSK3β磷酸化LRP5/6,导致复合体解聚,阻止β-catenin降解并在细胞质中积累,随后转入核内并和转录因子TCF/LEF结合,引起下游Wnt的不同靶基因的表达,调节生理过程。如图 1所示[7]。而在非经典通路中,不需要β-catenin的介入,包括Wnt/Ca2+通路、PCP通路和JNK信号通路[8]。研究发现一些拮抗剂可通过阻止Wnt/FZD/LRP5/6复合物的形成来调节Wnt/β-catenin信号通路,例如DKKs、sFRP和Wnt抑制因子。Wnt/β-catenin信号通路的异常活化能够导致β-catenin积累,促进HCC的发生发展[9]

图 1 Wnt/β-catenin信号通路[7] Fig 1 Wnt/β-catenin signaling pathway[7]
2 DKK在肝癌发展中的作用

许多报道指出一些细胞外蛋白质可以作为Wnt拮抗剂调节Wnt/β-catenin信号通路,例如SFRP、WIF-1和DKK[10-11]。在脊椎动物中,DKK蛋白家族包括4个成员,分别为DKK1,DKK2,DKK3和DKK4,其具有不同的生化和生理特性。DKK家族共享两个保守的富含半胱氨酸的结构域,N端的cysteine-rich对于每种类型的DKKs都是特异的,而C端在每个成员中是保守的。DKK在肿瘤细胞系或组织中的表达(结直肠癌、卵巢癌、胃癌和肾细胞癌)均有研究。本文主要综述DKK家族在肝癌发生发展中的作用。

2.1 DKK1

1998年人们首次研究了DKK1在非洲爪蟾头部发育中的作用。该研究组发现负责神经板和头部形成的胚胎细胞群分泌的DKK1抑制了爪蟾胚胎中Wnt信号通路[12-13]。后来Krupnik等[14]从人胎肾cDNA文库中分离出DKK1克隆序列。人DKK1基因长度为1815 kb,蛋白由266个氨基酸组成,相对分子质量约为29 kDa。有研究表明在肺腺癌中,DKK1由于表观遗传修饰表达降低,然而DKK1在另一些肿瘤中是过表达的,比如肝癌、肺癌、食道癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌和多发性骨髓瘤。关于DKK1在肝癌中是致癌还是抑癌仍然存在分歧。

p53是细胞中最重要的肿瘤抑制基因之一,可作为转录因子调节大量靶基因的表达。Wnt基因是一个可以促进肝细胞癌变后增殖和转移的原癌基因。研究发现,当p53功能消失时,Wnt能够加剧肿瘤的发生。Wang等[15]用p53缺失的腺病毒载体转染Hep3B细胞,RT-PCR方法检测发现DKK1在20 h后开始表达,且逐渐增加,32 h达到高峰,提示p53可调节Wnt信号通路抑制剂DKK1。表明p53介导的DKK1对Wnt信号传导具有拮抗作用。

全基因组DNA低甲基化和启动子区特异性高甲基化可导致形成广泛的癌症,包括HCC[16]。过度的高甲基化可导致关键基因的转录沉默。这些基因包括,抗肿瘤基因、细胞增殖抑制基因(p16INK4A, p21, p27, RASSF1A, SOCS1-3)、细胞凋亡(CASP8)、转移(E-Cadherin)和DNA修复(GSTP1)等。研究发现在肝硬化和肝癌组织中DKK1的甲基化程度均高于正常肝脏组织,并且mRNA水平降低,表明肝癌转移是由于DKK1的甲基化修饰引起其表达沉默所致[17]。Liang等[18]通过MSP和RT-PCR研究,表明在癌组织中DKK1和DKK3的甲基化水平最高,mRNA水平最低。在Aza处理后,DKK1和DKK3的mRNA水平升高58.9~59.3倍。表明在肝癌组织中,DKK1由于其甲基化而表达下降。Qin等[19]将H7402改造成转移肝癌细胞系M-H7402,通过相关检测发现DKK1和磷酸化β-catenin在M-H7402中表达显著下降,而β-catenin表达上调并且在细胞核中积聚,DKK1表达下降促进H7402细胞的转移。另有研究发现,DKK1通过激活β-catenin/MMP7信号通路促进HCC细胞迁移和侵袭发挥致癌作用[20],表明DKK1可能作为一个HCC治疗的潜在靶标。

然而,Yu等[21]得到了相反的结论,他们发现DKK1在转移性肝癌细胞系中和肝癌复发病人中过表达,这意味着DKK1在肝癌中作为一个致癌因子而不是抑癌因子。可见,DKK1在HCC发生发展中的作用仍需进一步研究。

另外,研究发现miR-217通过负调控DKK1,激活Wnt/β-catenin信号通路,促进肝细胞癌的致瘤性[22]。此外,在临床方面,有研究指出DKK1和AFP联合应用比单独应用AFP具有更好的诊断率,单独使用AFP优于DKK1和DKK3[23]。另一研究发现利用CSCs cDNA微阵列数据库鉴定了DKK1 mRNA在HCC组织中的表达,可以反映HCC患者的肿瘤特异性,其有望成为HCC一个新的预后指标[24]

2.2 DKK2

DKK2作为DKK家族的一员,和其他成员不同,研究的报道最少。近年来,DKK2的表观遗传沉默现象在结直肠癌、胃癌[25]、肾癌[26]、卵巢癌[27]等诸多肿瘤中已被证实。在卵巢癌方面,Zhu等[27]体内外实验均发现DKK2的表达增强会抑制Wnt/β-catenin通路,进而抑制肿瘤生长。DKK2也可能是乳腺癌正常亚型的一种潜在的预后生物标志物。

Lin等[28]通过转染Huh7细胞来研究DKK2在Wnt/β-catenin信号通路中的作用,发现DKK2可作为Wnt3a的拮抗剂来抑制细胞增殖,并且具有剂量依赖性。在DKK2缺陷型小鼠模型的研究显示,小鼠DKK2的缺失与肝癌的发生和干细胞特性的富集有关。总之,DKK2可能通过Wnt依赖和独立机制在肝癌发生过程中发挥作用,可作为流行病学研究的生物标志物。此外,miR-197能够诱导HCC细胞侵袭,DKK2通过β-catenin信号通路发挥作用。

另有研究发现,与相应的非癌性肝硬化组织(16%,50例中8例)相比,HCC组织中DKK2启动子区显著甲基化(42%,50例中21例),表明DKK2通过甲基化发挥其在肝癌中的作用[29]。DKK2与HCC预后的关系尚未见研究,仍有待进一步证实。在卵巢癌方面,Zhu等[27]体内外实验均发现DKK2过表达,其下游Wnt信号基因cyclin D1和c-Myc表达减少,进而抑制卵巢癌细胞的侵袭。

2.3 DKK3

DKK3可作为一种肿瘤抑制因子在肝癌中发挥作用。Hsieh等[30]报道指出,相较于人正常肝组织,DKK3 mRNA在人肝癌组织中表达水平降低。相较于肝硬化组织样本,肝癌组织中DKK3甲基化发生频率、甲基化水平更高,提示DKK3启动子甲基化可能是肝硬化向肝癌转变的一个重要事件[29]。此外,DKK3启动子甲基化与肝癌手术切除后不久复发或转移后生存率降低有关。因此,DKK3基因甲基化在肝癌中具有重要意义,但具体机制尚不明确,有待进一步研究。

上述DKK3的研究均局限在肝癌组织中,血清中DKK3蛋白水平或DKK3启动子甲基化目前尚未见报道。在乳腺癌和急性淋巴细胞白血病(ALL)中DKK3表达降低,DKK3可以作为这些疾病的潜在的治疗靶点和诊断的生物标志物,但在肝癌中还未得到有力的证实。

微小RNA(miRNA)直接结合靶mRNA的3′-非翻译区(UTR)沉默基因。因此,miRNA参与包括细胞存活,增殖,分化,凋亡,迁移,自噬,侵袭,血管生成和肿瘤发生等多种生物过程。近几十年来,一些报道指出miRNA的失调与癌症的发展和进展相关。MiRNA-125在许多物种中高度保守,miR-125b可直接结合DKK3的3′UTR区域(核苷酸626和648之间的序列),下调DKK3表达,调节肿瘤的发生和发展。Pei等[31]发现GATA4是一种在肝母细胞瘤增殖期间抑制miR-125b表达并诱导DKK3活化的上游因子。GATA4/miR-125b/DKK3通路可能作为一个新型小儿肝母细胞瘤患者的治疗靶点。值得关注的是,GATA4在哺乳动物肝脏发育中扮演着特定的角色。一些研究表明GATA4表达缺失发生在许多癌症中,包括上皮性卵巢癌,肾上腺皮质肿瘤,肝细胞癌和结直肠癌等,表明GATA4可以作为TSG起作用。

2.4 DKK4

DKK4是DKK家族中最小的成员,目前有研究证实DKK4是Wnt信号通路中重要的调节因子,与肝癌和结肠癌相关[32]。据报道,DKK4过表达能够抑制细胞增殖、迁移和侵袭;相反通过shRNA敲低DKK4则可促进细胞增殖和侵袭[33],且在DKK4过表达裸鼠模型中观察到肿瘤尺寸变小。此外,DKK4高表达组的肝癌患者总生存率高于DKK4低表达组,证实DKK4能够抑制肿瘤进展。

DKK4作为Wnt信号通路的重要调节因子,在肝癌发生发展中发挥重要作用。Fatima等[34]通过RT-PCR发现在HCC组织中DKK4 mRNA的表达下降47%,免疫组化分析发现相较于非肝癌组织,癌组织中DKK4蛋白表达减少58%左右。另有研究发现在44个肿瘤组织中DKK4 mRNA表达下降56.8%,以及芯片发现DKK4在肝癌组织和癌旁组织的表达均低于正常肝脏组织。这表明DKK4可能通过抑制Wnt/β-catenin信号而发挥抑癌作用。通过瞬时转染DKK4的肿瘤细胞中细胞质中β-catenin水平下降,下游分子c-Jun,cyclinD1和CD44水平下调[34],而细胞核中β-catenin的变化未见报道,表明DKK4无法单独抑制经典Wnt信号通路,需要其他因子辅助。

在HCC细胞系中过表达DKK4后总GSK3β的水平没有变化,但是磷酸化的GSK3β下降。LiCl抑制GSK3β后通过稳定β-catenin能减少DKK4表达,进而抑制肿瘤细胞的增殖[33]。总之,活化的GSK3β对DKK4介导的抑制作用和β-catenin磷酸化十分重要。有研究报道大多数DKK4在细胞质中表达。β-catenin主要聚集在肝癌细胞的细胞质和细胞核中,但在邻近的肝组织中,发现β-catenin主要聚集在细胞膜和细胞质中,且表达下降。DKK4与细胞核中的β-catenin水平呈负相关。表明DKK4可以调节β-catenin入核而发挥作用。

此外,有文献报道,在T3介导下,TR能够结合DKK4基因启动子区1645-1629核苷酸,上调了DKK4水平,进而抑制肝癌细胞Wnt信号转导的活化及肿瘤进展[35-36]。同时,在高糖条件下,c-Myc、DKK4和β-catenin之间的相互作用可促进肝癌细胞增殖。高糖会减少DKK4蛋白并激活经典的Wnt信号,进而将β-catenin转运到细胞核中,加速HCC细胞增殖。这些结果证明DKK4抑制了高糖诱导的β-catenin依赖的HCC细胞增殖[33]

3 总结与展望

综上所述,DKK家族成员在肝癌的发生发展中可能具有不同的作用,其多种表达调控机制在疾病的预警方面也有重要意义。尽管Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK在肝癌发生发展进程中起到了关键的作用,但仍然有一些细节尚不清楚,如DKK1致癌或者抑癌作用与什么因素有关?DKK2在肝癌预后方面是否发挥作用?DKK3在肝癌组织中甲基化下调的具体作用机制是什么?等问题尚待进一步阐明。因此,深入理解Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK家族成员的具体作用机制,阐明其在肝癌发生发展中的研究具有重要意义。

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王晓艳, 权会琴, 杜虹, 申焕君, 王平忠
WANG Xiaoyan, QUAN Huiqin, DU Hong, SHEN Huanjun, WANG Pingzhong
Dickkopf家族在肝癌发生发展中的作用研究进展
Recent progress of Wnt pathway inhibitor Dickkopf in the development of hepatocellular carcinoma
大连医科大学学报, 2020, 42(3): 247-251, 269.
Journal of Dalian Medical University, 2020, 42(3): 247-251, 269.
通信作者
王平忠, 教授。E-mail:wangpz63@163.com.
基金项目
国家自然科学基金项目(81602462)

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